過氧化氫酶（Catalase，CAT）試劑盒說明書 |
||||||||||||||||
|
||||||||||||||||
| 文件下載 | ||||||||||||||||
| 詳細介紹 | ||||||||||||||||
過氧化氫酶（Catalase，CAT）試劑盒說明書 紫外分光光度法 測定意義： CAT(EC 1.11.1.6)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中，是主要的H2O2清除酶，在活性氧清除系統中具有重要作用。 測定原理： H2O2在240nm下有特征吸收峰，CAT能夠分解H2O2，使反應溶液240nm下的吸光度隨反應時間而下降，根據吸光度的變化率可計算出CAT活性。 需自備的儀器和用品： 紫外分光光度計、臺式離心機、可調式移液器、1mL石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水 試劑組成和配制： 提取液：60mL×1瓶，4℃保存； 試劑一：60mL×1瓶，4℃保存； 試劑二：100uL×3瓶，4℃保存。 粗酶液提取： 1、細菌、細胞或組織樣品的制備： 細菌或培養細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。 組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。 2、血清（漿）樣品：直接檢測。 測定步驟： 1、分光光度計預熱30min以上，調節波長至240nm處，蒸餾水調零。 2、CAT檢測工作液的配制：用時在每瓶試劑二（100 uL）中加入20mL試劑一，充分混勻，作為工作液；用不完的試劑4℃保存一周； 3、測定前將CAT檢測工作液37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴10min。 4、取1mLCAT檢測工作液于1mL石英比色皿中，再加入35μL樣本，混勻；室溫下立即測定240nm下的初始吸光值A1和1min后的吸光值A2，計算ΔA=A1-A2 CAT活性計算： 1、血清（漿）CAT活力的計算: 單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘催化1nmol H2O2降解定義為一個酶活力單位。 CAT(U/mL)= [ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷V樣÷T=678×ΔA 2、組織、細菌或細胞中CAT活力計算： （1）按樣本蛋白濃度計算： 單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化1nmol H2O2降解定義為一個酶活力單位。 CAT(U/mg prot)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=678×ΔA÷Cpr （2）按樣本鮮重計算： 單位的定義：每g組織每分鐘催化1nmol H2O2降解定義為一個酶活力單位。 CAT(U/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總)÷T=678×ΔA÷W （3） 按細菌或細胞密度計算： 單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘催化1nmol H2O2降解定義為一個酶活力單位。 CAT(U/104 cell)＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（500×V樣÷V樣總）÷T =1.356×ΔA
V反總：反應體系總體積，1.035×10-3 L；ε：H2O2摩爾消光系數，4.36×104 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.035 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，1 min；W：樣本質量，g；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；500：細胞或細菌總數，500萬。 |
||||||||||||||||
